摘要：

在胃癌（GC）发生过程中，DNA甲基化转移酶3A的功能作用机制目前还不是很清楚。在该研究中，研究人员发现外源表达的DNMT3A通过打乱G1/S的转换而促进胃癌的细胞增殖。同时该研究找到了DNMT3A的下游靶基因p18INK4C，异位表达DNMT3A在转录层次抑制了p18INK4C的表达水平。在GC细胞中减弱p18INK4C的表达诱导细胞周期过程，在DNMT3A过表达细胞中重表达p18INK4C可减弱G1/S的转换。深入研究发现，DNMT3A通过直接调控p18INK4C启动子区的甲基化程度来影响其表达。临床GC样本检测发现，癌组织中p18INK4C的甲基化水平明显高于配对癌旁组织，DNMT3A的表达水平与p18INK4C的表达呈负相关。这些发现提出了胃致癌过程的新的见解，也为胃癌治疗提供了潜在的靶标。

在肿瘤发生的早期过程中，表观遗传调控机制——DNA甲基化起着非常重要的作用。真核细胞表达3个DNA甲基化转移酶：DNMT1，DNMT3A和DNMT3B。其中，已有研究发现DNMT1和DNMT3B在肿瘤的起始和发展阶段发挥着重要作用，但是，对于DNMT3A在肿瘤中的功能作用机制还不是很清楚。

胃癌在世界范围内，尤其是在中国，是一种最常见的高发病率和死亡率的恶性肿瘤之一。有研究发现DNMT3A在多种肿瘤（包括胃癌）中表达异常。在胃癌中，尤其是DNMT3A的表达明显比DNMT1和DNMT3B高。最近的研究也发现在胃癌病人中，只有DNMT3A的高表达伴随着差的总体生存率。这些发现预示着，在胃癌中，DNMT3A可能扮演着非常重要的角色。因此，深入研究胃癌发生过程中DNMT3A的功能作用机制显得尤为重要。

研究思路：

1.DNMT3A对GC细胞的增殖非常重要

2.DNMA3A通过打乱G1/S的转换促进细胞生长

3.DNMT3A下游靶基因鉴定

为了深入研究DNMT3A调控胃癌细胞周期过程的作用机制，研究人员进行了下游调控基因筛选。通过对过表达细胞系和对照细胞系表达谱芯片（HTA2.0）检测后发现，有558个下调和348个上调基因。GO分析发现主要的分子功能涉及结合与催化活性功能，生物学过程涉及细胞增殖，细胞粘附，细胞周期过程等，暗示着DNMT3A可能通过这些过程影响致癌。

在其中有5个下调基因与细胞周期过程相关：BLM, CDKN1B, CCNE2,p18INK4C和CKS1B，他们与CDK的活性调控关系密切。qRT-PCR结果验证表明DNMT3A抑制了p18INK4C表达，当在过表达细胞系MKN45-DNMT3A中加入DNA甲基化转移酶抑制剂（5-Aza）后，p18INK4C的表达异常得到恢复。这些结果表明p18INK4C是DNMT3A的主要下游靶基因。

流式细胞分选实验表明，在细胞中敲降p18INK4C可以增加G1/S转换的细胞数量。Western blot分析显示，CDK4和CDK6的蛋白表达增加。当在DNMT3A过表达细胞系中重表达p18INK4C后发现细胞生长速率减慢，G1期的细胞比率恢复。异位表达p18INK4C可以抑制CDK4和CDK6的蛋白表达。这些结果表明p18INK4C参与DNMT3A诱导的G1/S转换。

5.DNMT3A通过DNA甲基化抑制p18INK4C的表达

DNMT3A敲降细胞系BGS检测p18INK4C启动子区CpG island区域，发现甲基化程度明显低于对照。ChIP实验表明DNMT3A可结合到p18INK4C启动子的CpG island区域。这些结果表明DNMT3A可以直接结合到p18INK4C启动子区的CpG island区域影响其甲基化程度。

6.临床GC样本中p18INK4C甲基化程度异常

25对临床GC样本和癌旁样本检测p18INK4C启动子区的25个CpG位点，发现癌组织中甲基化水平明显高于癌旁，p18INK4C的mRNA水平也显著降低。

7.临床GC样本中DNMT3A与p18INK4C表达相关

35对临床GC样本和癌旁样本检测DNMT3A表达，发现有22个（63%）中蛋白表达升高，并且与临床病理指标一致。qRT-PCR检测p18INK4CmRNA表达水平发现其与DNMT3A蛋白表达水平负相关。